摘要杂交瘤细胞融合后集落形成不足、单克隆化培养时长孔少是单克隆抗体制备过程中需要关注的培养问题。Hybriboost 是一种化学成分限定的杂交瘤细胞生长补剂可用于 HAT 筛选、单克隆化及已建立细胞株的常规培养。本文结合 NS-1、SP2/0 两种骨髓瘤融合伴侣的比较实验介绍其对融合后集落形成和克隆培养长孔数的影响并说明抗人转铁蛋白杂交瘤克隆 L3B5 的抗体分泌检测结果、补剂配制方法与保存条件为杂交瘤培养体系优化提供参考。关键词杂交瘤细胞培养、杂交瘤克隆效率低、HAT筛选、单克隆化、杂交瘤生长补剂、饲养层、Hybriboost、单克隆抗体制备从 B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合到获得能够稳定分泌目标抗体的单克隆细胞株需要经历选择性培养、抗体筛选和单克隆化等环节。新融合的杂交瘤细胞对培养环境较为敏感如果融合后的集落生长不足或者进入单克隆化阶段后难以形成可继续扩增的集落后续能够用于检测和筛选的细胞材料就会受到限制。因此评价杂交瘤培养条件时除了关注是否出现集落还需要分别记录集落数量、长出集落的孔数以及后续目标抗体检测结果明确培养支持作用发生在哪个环节。一、杂交瘤细胞生长剂是什么适合加入哪些培养阶段杂交瘤细胞生长剂Hybriboost货号 HM-01是一种专门用于杂交瘤细胞培养的生长补剂具有化学成分限定、成分及浓度明确的特点补剂本身无动物来源成分、无血清、无蛋白。它的用途是为杂交瘤细胞提供生长支持可在 HAT 筛选阶段添加至相应培养基也可用于单克隆化过程中维持克隆生长以及已建立杂交瘤细胞株的常规培养与抗体制备。这里所说的“无血清、无蛋白”描述的是补剂本身本文展示的比较实验使用了含胎牛血清的 FCS 培养体系不能将这些实验理解为完整无血清培养体系的验证。对于融合后集落较少的实验关注点是细胞在选择性培养期间能否形成更多可供后续筛选的集落对于单克隆化阶段长孔不足的实验关注点则是接种后有多少孔能够支持集落生长。Hybriboost 的应用覆盖这两个阶段但生长补剂承担的是培养支持作用不能替代 HAT 选择、目标抗体检测或单克隆来源确认。将这些任务分开记录可以更准确地判断补剂是否改善了当前实验中的培养表现。二、融合后第14天的集落数NS-1和SP2/0的比较结果研发方的验证实验将新形成的聚乙二醇PEG融合杂交瘤细胞接种到 96 孔板设置含 Hybriboost 的 FCS 培养基、含饲养层的 FCS 培养基和常规 FCS 培养基三组在融合后第 14 天计数每块板中的杂交瘤集落。实验分别采用 NS-1 和 SP2/0 两种骨髓瘤融合伴侣各进行 4 次独立融合以观察不同融合背景下的集落形成情况。这样的比较关注的是融合后的培养结果而不是直接测定细胞融合事件发生的概率。在图示实验中NS-1 和 SP2/0 两组融合体系均表现为 Hybriboost 组的集落数高于饲养层组及常规 FCS 组。以 NS-1 为例Hybriboost 组每块 96 孔板约形成 900–1500 个集落饲养层组约为 130–250 个常规 FCS 组约为 70–120 个。这一结果体现了相应实验条件下融合后集落形成的改善图中的统计单位是“集落数/96 孔板”一孔可以出现多个集落因此该数值既不是长孔数也不是已经确认的单克隆细胞株数量。图1三种培养条件下融合后的杂交瘤集落数NS-1和SP2/0各进行4次独立融合融合后第14天计数。三、单克隆化培养表现长出集落的孔数应如何理解除每板集落总数外验证资料还通过显微镜观察记录每块 96 孔板中出现集落生长的孔数。图 2 中Hybriboost 组在 NS-1 融合体系下约有 90–96 孔长出集落SP2/0 融合体系下约有 66–89 孔NS-1 对应的饲养层组约为 34–78 孔常规 FCS 组的长孔数多数不超过约 45 孔。图示结果表明在这些实验条件下Hybriboost 组有更多培养孔形成了可观察的集落为后续克隆培养和筛选提供了更多可继续处理的孔。需要准确区分的是图 2 的纵轴为每块 96 孔板中的长孔数而不是百分比如需计算长孔比例应将长孔数除以相应统计孔数。长孔这一观察结果反映培养孔中发生了集落生长但不直接证明其中细胞分泌目标抗体也不能仅凭长孔情况确认细胞来自单个起始细胞。因此在讨论“单克隆化成功率”时应同时交代实际统计指标并把目标抗体阳性结果和单克隆来源确认作为后续独立评价内容。图2NS-1和SP2/0体系在三种培养条件下的长孔数。纵轴表示每块96孔板中出现集落的孔数不是百分比。四、增加培养支持是否影响抗体分泌杂交瘤培养优化不仅需要观察细胞和集落生长还要关注抗体分泌表现。验证实验选择抗人转铁蛋白杂交瘤克隆 L3B5分别在含 Hybriboost 的 FCS 培养基、含饲养层的 FCS 培养基及常规 FCS 培养基中培养 7 天收集培养上清并通过酶联免疫吸附测定ELISA的 A410 读数比较抗体分泌相关信号。三组读数均随培养时间增加而升高第 7 天处于接近的水平未显示 Hybriboost 组抗体分泌检测信号受到明显抑制。这组结果支持的是 L3B5 克隆在该培养和检测条件下的表现不宜直接扩展为所有杂交瘤细胞的抗体产量、亲和力或质量均不受影响。对于正在调整培养体系的研究可以将集落形成和抗体检测共同纳入比较既观察是否获得更多可继续培养的细胞材料也确认目标抗体检测结果是否符合需求。有关补剂定位及适用环节可结合 Hybriboost相关技术资料 理解。图3抗人转铁蛋白杂交瘤克隆L3B5在三种培养条件下的抗体分泌检测结果以ELISA A410读数呈现。五、促杂交瘤细胞生长补剂配制方法与保存条件Hybriboost 的 50 mg 规格可用于配制 1 L 培养基5 mg 规格对应 100 mL 培养基。使用时需要区分未开封粉末、双蒸水配制液以及加入培养基后的状态因为三者的保存条件和可保存时间不同。尤其是在小规模比较实验中合理安排配制量和实验时间有助于保持不同实验组的处理条件一致避免将配制液保存时间的差异与补剂效果混在一起。项目参数货号HM-01 / HM-01-sample规格50 mg / 5 mg可配制 1 L / 100 mL 培养基保存条件未开封 2–8℃避光保存配制于双蒸水后 −20℃保存不超过 3 个月配制于培养基中 2–8℃保存不超过 2 周表1Hybriboost的货号、规格与不同配制状态下的保存条件。以 50 mg 规格为例可以采用两种配制方式。第一种是用 5 mL 双蒸水溶解粉末与 1 L 培养基充分混匀再经 0.22 μm 滤器过滤后使用第二种是用 1 mL 双蒸水溶解粉末先经 0.22 μm 滤器过滤再与已经过滤的 1 L 培养基混匀。两种方式的主要区别在于溶解体积和过滤顺序应按所选方法完整执行保持配制与加入培养基过程的无菌操作。六、如何安排能够解释结果的对照实验初次评估时可以优先选择当前最需要改善的一个阶段例如融合后筛选培养或单克隆化培养集中使用样品完成对照而不是同时展开两个阶段。比较时尽量采用同批细胞、同批血清和同日铺板在一致的培养背景下改变补剂这一项因素如果同时改变基础培养基、血清或其他培养条件就难以将结果差异归因于补剂。需要与饲养层方案比较时也应将不同培养方案及其具体条件分别记录清楚。实验记录可以围绕每板集落数、出现集落的孔数及比例、后续单克隆的目标抗体阳性率展开分别对应集落形成、培养孔生长和目标抗体筛选三个层面。Hybriboost 的现有验证结果提供了融合后集落数和长孔数改善的依据也展示了 L3B5 克隆的抗体分泌检测表现将这些指标放回各自的实验阶段才能判断培养改善是否进一步转化为当前研究所需要的有效克隆。关于技术来源本文基于促杂交瘤细胞生长剂Hybriboost技术资料及研发方验证图表曼博生物MineBio整理用于科研信息分享与实验参考。图中数值范围为近似读数实际表现可能随细胞株、培养基配方及操作条件变化。