1. 什么是 WGCNAWGCNAWeighted Gene Co-expression Network Analysis加权基因共表达网络分析是一种用于研究高维分子数据中变量之间协同变化模式的方法。它最常用于RNA-seq 转录组数据芯片基因表达数据蛋白组数据代谢组数据DNA 甲基化数据WGCNA 的核心思想如果一组分子参与相同的生物过程它们往往会在不同样本中表现出相似的变化模式。因此可以根据变量之间的共表达关系将大量变量划分为若干模块module并进一步研究这些模块与疾病、环境暴露或临床表型之间的关系。2. WGCNA 与传统差异分析的区别2.1 差异分析关注单个变量例如疾病组 vs 健康组Gene A ↑ Gene B ↑ Gene C ↓得到的是哪些基因表达改变哪些代谢物改变哪些蛋白改变重点单个分子与表型之间的关系。2.2 WGCNA关注变量网络WGCNA 不关注单个变量而关注哪些变量具有相似变化趋势并共同形成一个功能模块。例如Gene A Gene B Gene C Gene D 共同升高或降低 ↓ Module 1重点分子之间的协同变化模式。3. WGCNA 的基本假设WGCNA 基于以下假设3.1 共表达代表潜在功能联系如果两个基因在大量样本中同时升高同时降低说明它们可能受到共同调控参与相同生物过程存在功能联系例如Sample 1: Gene A ↑ Gene B ↑ Gene C ↑ Sample 2: Gene A ↓ Gene B ↓ Gene C ↓说明Gene A Gene B Gene C 具有相似表达模式4. WGCNA 分析流程整体流程高维表达矩阵 ↓ 计算变量之间相关性 ↓ 构建加权共表达网络 ↓ 识别变量模块 ↓ 计算模块eigengene ↓ 关联临床表型 ↓ 寻找hub变量5. 输入数据WGCNA 输入通常为行样本列变量例如基因例如SampleGene1Gene2Gene3Sample12.13.55.2Sample21.83.14.9Sample34.26.58.06. 计算变量之间的相关性首先计算任意两个变量之间的相关系数cor(xi,xj) cor(x_i,x_j)cor(xi​,xj​)例如Gene1 与 Gene2 r 0.85 Gene1 与 Gene3 r 0.20表示Gene1 和 Gene2 具有高度同步变化Gene1 和 Gene3 变化关系较弱7. 构建加权共表达网络7.1 为什么叫 Weighted加权传统网络通常采用相关 阈值 ↓ 存在连接否则无连接这种方法会丢失相关程度的信息。WGCNA 使用连续权重aij∣cor(xi,xj)∣β a_{ij}|cor(x_i,x_j)|^\betaaij​∣cor(xi​,xj​)∣β其中aija_{ij}aij​两个变量之间的连接强度betabetabetasoft threshold power例如相关系数Gene A-Gene B: r 0.9 Gene A-Gene C: r 0.2经过转换后高相关变量 0.9^β 保持较强连接 低相关变量 0.2^β 接近0因此网络会突出强共表达关系。8. 模块Module的识别构建网络后根据变量之间的连接关系进行聚类。最终得到多个模块例如Blue module: Gene1 Gene5 Gene20 Gene100 Brown module: Gene2 Gene8 Gene50模块代表一组具有相似表达变化模式的变量集合。注意WGCNA 聚类的是变量而不是样本。即WGCNA回答哪些变量属于同一个网络而不是哪些个体属于同一类型9. Module Eigengene模块特征值一个模块可能包含几十到几千个变量。例如Inflammation module: 500 genes为了表示整个模块需要将多个变量压缩为一个指标。WGCNA 使用模块内变量表达矩阵的第一主成分PC1作为模块代表。称为Module EigengeneME例如SampleModule score11.22-0.530.8因此每个模块最终都会产生每个样本对应的连续模块得分。该得分代表该模块整体活跃程度。10. 模块与表型关联获得模块得分后可以分析10.1 与疾病状态关联例如Module score ↓ Disease status发现疾病组Module score ↑说明该模块与疾病相关。10.2 与连续变量关联例如Module score ↓ Clinical measurement可以使用Pearson correlationSpearman correlationRegression model分析模块与表型之间的关系。11. Hub gene核心变量模块内部不同变量的重要程度不同。通常通过Module MembershipMM衡量变量与模块eigengene之间的相关性。例如GeneMMGene A0.95Gene B0.90Gene C0.40Gene A最能代表该模块。通常称为Hub geneHub gene 被认为可能是该模块中的关键调控节点。12. WGCNA 与 PCA 的区别两者都可以产生连续潜变量。PCA目标降低数据维度。例如10000 genes ↓ PC1 PC2 PC3PC代表最大解释数据变异方向。WGCNA目标寻找具有共同变化模式的变量网络。例如Gene1 Gene2 Gene3 ↓ Module然后Module ↓ Module eigengene区别方法主要关注PCA整体数据变化方向WGCNA变量之间的共表达网络13. WGCNA 与 LPA/LCA 的区别两者都属于无监督学习但分析对象不同。WGCNA聚类对象变量例如Gene1 Gene2 Gene3 ↓ Module输出连续变量Module score含义某个生物过程在个体中的活跃程度。LPA/LCA聚类对象个体例如Person1 Person2 Person3 ↓ Class 1 Class 2 Class 3输出类别变量Latent class membership含义个体属于哪一种潜在模式。14. WGCNA 的主要应用14.1 发现疾病相关模块分子表达数据 ↓ 疾病相关模块14.2 寻找关键分子Module ↓ Hub genes14.3 连接分子层和表型层Molecular profile ↓ Module ↓ Clinical phenotype15. WGCNA 的局限性15.1 只能说明关联WGCNA发现某模块与疾病相关不能证明该模块导致疾病需要结合实验验证遗传学方法纵向研究15.2 对样本量要求较高样本量越大模块越稳定结果越可靠15.3 对数据质量要求较高分析前通常需要去除异常样本批次校正数据标准化去除低表达变量16. 总结WGCNA 是一种基于变量共表达关系构建加权网络的方法。核心流程高维变量矩阵 ↓ 变量相关性计算 ↓ 加权网络构建 ↓ 模块识别 ↓ 计算模块eigengene ↓ 关联表型 ↓ 寻找hub变量最核心的理解WGCNA 将大量单独变量转换为若干具有潜在生物意义的连续模块评分用于描述不同样本中某类生物过程的整体活跃程度。与 LPA 的区别WGCNA 聚类变量得到连续模块得分LPA 聚类个体得到类别归属。标准 WGCNA 识别的模块modules通常是互不重叠的即每个蛋白最多只被分配到一个模块。例如假设有 3,000 种蛋白WGCNA 识别出以下模块模块 蛋白数量 蛋白示例Blue 350 IL6、CXCL8、CCL2Brown 420 VEGFA、ANGPT2Turquoise 600 GDF15、TNFRSF1AGrey 1,630 未分配到明确模块的蛋白以上为假设数据。这里有几点需要区分一个蛋白只能被分配到一个模块。 例如 IL6 被分到 Blue 模块就不会同时被分到 Brown 模块。不同模块之间仍然可以存在相关性。 例如 Blue 和 Brown 模块的 Module Eigengene 可能高度相关WGCNA 可以进一步合并相似模块。一个蛋白可以与其他模块的蛋白相关。 模块不重叠不代表模块之间完全独立。Grey 模块通常表示未被分配到明确共表达模块的蛋白并非真正的共表达模块。与 MOFA 的关键区别假设 IL6 同时参与炎症反应和代谢调控WGCNA通常只把 IL6 分配到一个模块但可以计算它与其他模块的相关性例如模块成员度module membership。MOFAIL6 可以在 Factor 1 和 Factor 2 上同时具有较高的权重因此能够参与多个潜在共变模式。不过MOFA 的因子并不是彼此独立的蛋白集合而是数据变化的不同潜在维度。因此如果你希望识别允许蛋白重叠的共表达模块标准 WGCNA 并不是最合适的方法。 可以考虑重叠社区检测overlapping community detection、非负矩阵分解NMF或稀疏因子分析等方法但它们对“模块”的定义也有所不同。还有一个值得注意的地方WGCNA 的模块不重叠是算法分配规则并不意味着真实生物学中一个蛋白只参与一个功能通路。