一、获取已知引物-- PrimerBank链接PrimerBank1、选择Keyword物种可选所有种类或人或鼠输入目标基因名点击Submit。注若是不确定准确人源基因名可在HGNC人类基因官方命名库查询。Home | HUGO Gene Nomenclature Committee2、出结果Amplicon Size 137扩增子长度 137 bp一般qPCR 理想区间80–150bp稍扩大范围也是可以的下方红框分别是前后引物的序列可以直接发给公司来做、Length长度推荐18–24 nt最常用最优20–22 nt、Tm解链温度一般是58-62℃前后引物的Tm差越小越好。注要注意确认Gene Descriptions的信息是否是你的目的基因此图仅为展示。3、验证引物--Primer-BLAST在NCBI中的BLAST中验证初步引物特异性。点击这个链接BLAST: Basic Local Alignment Search Tool进入页面往下滑得下图选择Primer-BLAST。接着进入下图这个界面。先分别输入从PrimerBank中得到的前后引物序列注意不要搞错顺序接着修改PCR product size一般为70-200bp适用于qPCRTm温度可修改为58-62℃Max Tm difference也修改为2将页面往下滑到Advanced paramsters的设置中得下图将Primer Size修改为18-25nt若是18则特异性差容易乱结合25则Tm 容易过高二级结构风险上升如发卡结构将Primer GC content修改为40-60GC 太低则引物结合力弱Tm 偏低GC60%则容易形成发夹、引物二聚体非特异扩增变多。其他保持默认。接着滑到页面最底部勾选Show results in a new window点击Get Primers。出现以下界面等待一会儿等运行完成点击Check。进入下图的界面首先看Products on target templates的区域列着不同的 mRNA 转录本看扩增产物是否都为目标基因的产物若是出现不同基因的产物则说明引物特异性不佳最好换一个但是有一个特殊情况若是那个不同基因的产物size五六百总之与目标基因的差好几百影响就没那么大但也是有一些影响的。再看看引物的基本信息作为参考Self complementaritySelf 和3 complementarity是指自互补性与 3端互补性数值越小越好说明引物自身形成发夹结构、或两条引物互相结合形成“引物二聚体”的概率都很低不会严重干扰目标序列的结合。若是扩增产物都为目标基因的产物以及引物的基本信息符合qPCR的标准那么这对引物序列就可以发给相应公司制作随后再做分子实验进行进一步的验证。二、设计引物--Primer3Plus若是在PrimerBank没有目标基因的引物序列或是特异性太差等原因则可以自己设计引物的序列。1、确认目的基因的转录本序列:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/进入网页后检索目的基因选择符合要求的目的基因的条目注意基因的来源是什么动物一般排在前面的匹配度较高。进入下一个页面后可以看到这个基因的基本信息一直下滑到其mRNA and Protein的栏目点击第一个转录本一般排在前面转录本的优先级更高更推荐使用。REVIEWED表示由人工审核过更加可信。进入这个转录本的网页后可以简单看看相关信息往下滑先点击CDS如下图随后页面自动去到基因序列如下图复制其高亮的部分。2、进行引物设计进入Primer3Plus - Pick Primers这个网站。将settings选择为qPCR在Main中将前面复制的序列粘贴到指定区域如下图。接着在中间栏点击General Settings设置参数Product Size Ranges改为70-200Primer Size为18-25Primer Tm为58-62Max Tm Difference改为2Primer GC%为40-60其他保持默认。最后点击绿色按钮Pick Primer。出结果可以看看这两个引物的基本情况是否适合一般首先出现的引物是算法综合评分高的推荐使用的引物若是不满意也可以点击Next Primer Pair查看下一组引物。确定引物后复制前后引物的序列进行特异性的验证。3、验证引物--Primer-BLAST与前文的验证引物的方法一致这里不赘述。最后再进行分子实验验证。参考如何设计qPCR引物序列_self complementarity-CSDN博客【经验分享】NCBI设计引物——最详细说明及教程适合0基础~-CSDN博客https://www.bilibili.com/video/BV16B4y1u732/?spm_id_from333.337.search-card.all.click若有出错恳请指正