大鼠主动脉内皮细胞AECs的分离与培养简介主动脉属于弹性动脉管径较大管壁约占管径的1/10分为内膜、中膜和外膜各层的结构特点如下。内膜占管壁厚度的1/6左右由内皮和内皮下层构成内膜与中膜无明显界限邻近内皮下层的第一层弹性膜即为内弹性膜。2、中膜最厚含4070层呈同心圆排列的弹性膜。弹性膜由弹性蛋白构成弹性膜上有许多窗孔各层弹性膜由弹性纤维相连弹性膜之间还有环行平滑肌纤维和胶原纤维。3、外膜较薄由疏松结缔组织构成含纵向螺旋状排列的胶原纤维束和弹性纤维以及成纤维细胞和少量平滑肌纤维外弹性膜不明显紧邻中膜的一层断断续续的弹性膜即为外弹性膜。在降主动脉中以隔膜为界分为胸主动脉与腹主动脉在胸主动脉中分支较少腹主动脉中分支较多在分离时应需将分支去除胸主动脉比腹主动脉较粗更容易分离外膜。主动脉内皮细胞的培养方法主要包括酶消化法和组织块压片法。由于酶消化法获得的细胞活性较差组织块压片法存在周期长、纯度低等缺点。故目前一般采用消化压片法。消化压片法二、材料1、实验动物两周龄SD大鼠3只雌雄不限2、组织来源主动脉血管3、手术器材显微解剖镜眼科剪眼科镊子无菌盖玻片冰袋4、消化酶Ⅱ型胶原酶5、培养基 ECM培养基三、实验步骤方法一血管内皮翻面消化压片法1. 脱颈法处死周龄大鼠2周左右放入75%的酒精中浸泡消毒5min。2. 快速打开大鼠胸腹腔分离出主动脉置于含有PBS (含2双抗的6cm培养皿中转移至无菌操作台内。整个脊柱剪下主动脉附着于脊柱之上。3. 使用眼科微剪和镊子轻轻去除血管外周脂肪、结缔组织等附着的其他组织。使用PBS漂洗次去除外部杂质及血细胞并转移至另一个装有PBS (含2双抗6cm培养皿中。4. 血管内皮翻面眼科镊子压住血管开口2-3mm的地方将血管远端从管壁外侧顶入远端管口内。交替松开和夹持血管壁将血管远端从远端管腔内逐渐递向近端管腔自近端管口翻转出内膜使得血管内膜暴露在外。用PBS漂洗次去除残留的血细胞然后吸弃多余PBS。5. 采用消化压片法处理翻转的血管组织: 加入2mg/ml Ⅱ 型胶原酶 2l37℃下消化30min后弃去加入适量的含血清的培养基终止消化。6. 将主动脉剪成4-5段1.0左右长度的血管段转移6孔板中央每孔4-5段。用灭菌的盖玻片盖在血管段上方轻轻下压每孔加入2ml含20%胎牛血清ECM培养基进行培养。7. 将孔板置于细胞培养箱中培养72内禁止移动孔板。8. 后更换培养基之后每换液次。9. 倒置相差显微镜下观察细胞的生长状态待原代细胞生长覆盖底部80%以上时用0.25%的胰蛋白酶消化传代。方法二主动脉内外膜分离消化压片法1. 脱颈法处死周龄大鼠2周左右放入75%的酒精中浸泡消毒5min。2. 快速打开大鼠胸腹腔分离出主动脉置于含有PBS (含2双抗的6cm培养皿中转移至无菌操作台内。整个脊柱剪下主动脉附着于脊柱之上。3. 使用眼科微剪和镊子轻轻去除血管外周脂肪、结缔组织等附着的其他组织。使用PBS漂洗次去除外部杂质及血细胞并转移至另一个装有PBS (含2双抗6cm培养皿中。全程需在冰上操作以保证组织细胞的活性。4、在体式显微镜下用两个显微镊将主动脉的外膜撕开剥离干净外膜纤维组织。然后将主动脉沿纵向剪开将主动脉的内膜层撕下。5、将主动脉中膜层转移至新的PBS中清洗两次加入2mg/ml Ⅱ 型胶原酶 2l37℃下消化30min后弃去消化液用适量的含血清的培养基清洗2次。6、用剪刀将主动脉内膜剪成1mm3的小块在蘸取少量的培养基后贴入6孔板中每孔4-5块随后用灭菌的盖玻片盖在血管段上方轻轻下压每孔加入2ml含20%胎牛血清ECM培养基进行培养。7. 将孔板置于细胞培养箱中培养72内禁止移动孔板。8. 后更换培养基之后每换液次。9. 倒置相差显微镜下观察细胞的生长状态待原代细胞生长覆盖底部80%以上时用0.25%的胰蛋白酶消化传代。注意事项① 整个分离过程尽量在冰上操作② 前3天内禁止移动细胞③ 培养基消耗快定期换液。图.胸主动脉四、各阶段的大鼠主动脉内皮细胞的照片白光1、原代静置培养第4-6天100X组织块周边已有大量细胞爬出贴壁细胞呈梭形或多边形2、细胞传代后密度高和密度低时生长特性传代后密度低时AECs成典型的“网格状”或“管腔样”结构传代后密度高时的AECs呈现梭形和多角形的密集细胞群落形态五、大鼠主动脉内皮细胞的鉴定常用鉴定方法采用vWFvon Willebrand factor、FVⅢ(VⅢ因子)、CD31免疫荧光鉴定Von Willebrand Factor和VⅢ因子的免疫荧光染色vWF免疫荧光染色(200x) VⅢ因子免疫荧光染色(200x)此Protocol由武汉云克隆提供欢迎大家来讨论有什么疑问请联系武汉云克隆武汉云克隆深耕原代细胞领域近二十年依托自建SPF级动物房与GMP级细胞制备平台在兔源原代细胞领域形成了系统性的供应优势。公司已建成覆盖人、小鼠、大鼠、兔、犬、猪、羊、猫、豚鼠、鸡等10多个物种的海量资源库现货原代细胞突破600种配套4000余种细胞库存。在兔视网膜星形胶质细胞的生产中云克隆建立了从动物饲养到细胞分离培养的全链条质控体系每一批次均完成严格的质量鉴定与活性验证确保批间差异小、实验结果可重复。作为国内少数具备细胞出口资质的高新技术企业云克隆已整体通过ISO 9001:2015和ISO 13485:2016质量管理体系认证产品出口全球70余个国家和地区超过75%的服务对象位于欧美等发达国家。